強力なアシル - 重慶脂肪酸グループ株式会社

Nature Communications volume 14、記事番号: 1455 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

小分子がマラリア原虫を殺すためにどのように作用するかを特定することは、新たな「化学的に検証された」標的につながる可能性がある。熱帯熱マラリア原虫の無性血液段階の寄生虫に、構造的に無関係な新規の 3 種類の抗マラリア薬化合物 (MMV665924、MMV019719 および MMV897615) を投与し、耐性原虫系統の全ゲノム配列解析を行うことにより、熱帯熱マラリア原虫のアシル CoA シンテターゼにおける複数の変異を特定しました ( ACS) 遺伝子 PfACS10 (PF3D7_0525100、M300I、A268D/V、F427L) および PfACS11 (PF3D7_1238800、F387V、D648Y、および E668K)。対立遺伝子置換およびサーマルプロテオームプロファイリングにより、PfACS10 がこれらの化合物の標的であることが検証されます。我々は、このタンパク質が条件付きノックダウンによって寄生虫の増殖に不可欠であることを実証し、発現が低下すると化合物の感受性が増加することを観察しました。 PfACS10 の阻害はトリアシルグリセロールの減少とその脂質前駆体の蓄積につながり、その機能についての重要な洞察が得られます。 PfACS11 遺伝子とその変異の分析により、タンパク質の安定性の低下を介して耐性を媒介する役割が指摘されています。

マラリア撲滅に向けた目覚ましい進歩にも関わらず、2022 年世界マラリア報告書は、2021 年にマラリアによる新規症例数 2 億 4,700 万人、死亡者数 61 万 9,000 人と推定しています11。この疾患の治療に使用される抗マラリア薬の種類は限られており、ほぼすべての治療薬に対してある程度の耐性があります。流行地域の少なくとも一部の熱帯熱マラリア原虫寄生虫集団で発生しています。新しい経路を標的とする新しい抗マラリア薬の同定は、利用可能な薬剤のレパートリーを増やすために不可欠です。

過去 10 年間で、500 万を超える化合物が表現型スクリーニングで熱帯熱マラリア原虫に対してスクリーニングされ、低またはマイクロモル未満の活性を持つ 25,000 を超えるヒットが特定されました 2,3,4,5,6,7。これらのヒット化合物の化学的に検証された標的を特定すると、構造に基づいた創薬、フラグメントスクリーニング、DNAコードライブラリなどの強力なアプローチの利用を促進し、マラリア治療薬の発見と開発を加速することができます。 Malaria Drug Accelerator consortium (MalDA) は、全細胞表現型スクリーニングでヒットとして同定された小分子に焦点を当て、ケモゲノミクスアプローチ 8 を介して熱帯熱マラリア原虫の新規薬剤標的の同定を目指しています。このコンソーシアムの主な戦略は、耐性寄生虫の in vitro 進化とハイスループットの次世代シークエンシングを適用することであり、これにより複数の新規標的と耐性機構が同定されています 9、10、11、12。

今回我々は、3つの異なる化学足場（MMV665924、MMV019719、およびMMV897615）を用いたin vitro耐性進化実験の以前の報告を利用して、熱帯熱マラリア原虫アシルCoAシンテターゼ（PfACS）の保存されたメンバーである候補薬物標的PfACS10およびPfACS11についての新たな洞察を得る。酵素ファミリー8、12、13。 PfACS 酵素は長鎖脂肪酸合成酵素 (ACSL) に最も似ており、ACSL は 2 段階の ATP 依存プロセスで補酵素 A に結合することにより、12 ～ 20 の好ましいアシル鎖の遊離脂肪酸 (FA) を活性化します。、アシル-CoA14が生成されます。真核生物の ACSL は、特定の FA 基質の長さと飽和度に対して優先性を示します 15、16、17、18。寄生虫は宿主から FA を回収し 19,20、PfACS による FA の活性化により、FA が寄生虫の成長に不可欠なさまざまな脂質種に取り込まれることが可能になります。これには、脂肪滴中の中性脂質 (トリアシルグリセロールおよびジアシルグリセロール) の蓄積が含まれます 21,22。

対立遺伝子置換およびサーマルプロテオームプロファイリングを使用して、本発明者らは、本明細書において、PfACS10が必須タンパク質であり、MMV665924、MMV019719、およびMMV897615の標的であるという証拠を提供する。 PfACS10 の阻害は、トリアシルグリセロールの減少とその脂質前駆体の蓄積をもたらします。一方、PfACS11の突然変異の対立遺伝子置換は選択された系統の表現模写を行うが、我々の条件付きノックダウンデータは、PfACS11が無性寄生虫の増殖に必須ではないことを示しており、PfACS11が直接の標的ではなく抵抗性を媒介している可能性があることを示唆している。

0.01 from globally diverse isolates (www.malariagen.net/pf3k). The length of the bars represents the local MAF of each variant in West (blue) or East (purple) Africa. The selected variants are indicated by red, blue, and yellow arrows. Dark green boxes indicate the ACS motifs: P: P-loop, G: Gate motif, A: Adenine binding site, L: Linker. c Representative dose-response assay for a clonal line of CF04.008 (ACS10 M300, gray) and two clonal lines of CF04.009 (ACS10 M300I, red) from Malawi. Assays were run in triplicate and repeated twice. Shown are the average ±SD and the non-linear regression curve fit for one biological assay run in triplicate. Source data are provided as a Source Data file. MAF minor allele frequency, π pairwise nucleotide diversity within each country, FST divergence./p>0.01 are depicted in orange (Fig. 3 and Supplementary 4). Resistance-associated mutations are depicted in red./p>43% coverage of the P. falciparum proteome. This compares favorably with the coverage reported for previous TPP and cellular thermal shift assays coupled with mass spectrometry (MS-CETSA) studies with P. falciparum37,38. TPP datasets were analyzed using the standard melting temperature (Tm)-based method, as described in an earlier TPP publication39. This analysis assesses individual protein melt curves using several criteria including curve R2, variability in Tm values within the control sample, maximum curve plateau, and minimum slope. Melting point differences (ΔTm = Tm, treated–Tm, control) are then established for every detectable protein. Only the most significantly affected proteins are selected as potential “hits” by applying an FDR-adjusted z-test to ΔTm data. Proteins with a p-value <0.1 in two separate technical replicates are considered “hits”. Hits found in two biological replicas are considered as putative targets./p>

1.5, mapping quality > 40, min base quality score > 18, read depth > 5) to obtain high quality SNPs that were annotated using SnpEff version 4.3t68. BIC-Seq version 1.1.269 was used to discover copy number variants (CNVs) against the parental strain using the Bayesian statistical model. SNPs and CNVs were visually inspected and confirmed using Integrative Genome Viewer (IGV). All gene annotations in the analysis were based on PlasmoDB-48_Pfalciparum3D7 (https://plasmodb.org/plasmo/app/downloads/release-48/Pfalciparum3D7/gff/)./p>25% of samples, or showed high levels of heterozygosity within single infections (>25%). Additionally, 558 genes failed gene-level quality filters (≥20% heterozygous calls or ≥20% missing calls across samples) and were removed from the analysis. Calculations of pairwise nucleotide diversity (π) and Weir and Cockerham’s FST estimator were performed the PfalGeneDiversityStats package71./p>0.8. The statistical significance was calculated using a z-test and only proteins with a p-value < 0.2 in both technical replicates were considered hits. Hits found in two biological replicates were considered putative targets. Alternatively, we used the NPARC method (non-parametric analysis of response curves), a strategy that compares the experimental data to two models: a null model that assumes that drug has no influence on the protein melting behavior, and an alternative model that assumes that drug affects the melting behavior. Any data-driven adjustments to these models were calculated and assessed for statistical significance using an F-test, generating a p-value. All TPP datasets generated with MMV897615 have been deposited to the ProteomeXchange Consortium via the PRIDE partner repository77 under the identifier PXD034937./p>